O jogo começa mostrando um pequeno resumo sobre os acontecimentos de antigos jogos da série, e uma novidade: é anunciada a falência da Umbrella Corporation; devido as ações de Chris Redfield, Jill Valentine e Albert Wesker, fato relatado em Umbrella Chronicles. O protagonista de RE4 é Leon S. Kennedy, sobrevivente de Raccoon City, que agora trabalha como agente secreto para o governo americano. Leon deve investigar a suspeita de Ashley Graham, a filha do presidente, que foi seqüestrada, estar numa remota vila na Espanha. Leon é auxiliado por Ingrid Hunnigan, que lhe dá informações sobre o terreno. O principal antagonista é Osmund Saddler, líder do culto Los Illuminados e responsável por infectar os habitantes do vilarejo com a La Plaga, que planeja fazer o mesmo com o resto do planeta. Para isso, conta com a ajuda de Ramon Salazar, responsável por liberar as Plagas; Bitores Mendez, o prefeito do vilarejo; e Jack Krauser, um ex-companheiro de Leon nos anos de treinamento para o governo, supostamente morto dois anos antes. Ainda são incluídos Luís Sera, um misterioso cientista que trabalhava para Salazar, e se apresenta a Leon como um policial de uma cidade vizinha; Ada Wong, antiga paquera de Leon que, agora trabalha para Wesker, tem como objetivo obter uma amostra do parasita La Plaga; e Albert Wesker, ex-capitão dos S.T.A.R.S. que planeja a reconstrução da Umbrella Corporation. Em 2004, as atividades ilegais da Umbrella dentro de Raccoon City vieram a público. Após uma investigação conduzida pelo governo, vários diretores da empresa são presos. O governo suspende indefinitivamente os negócios da Umbrella, causando sua falência. Leon deve, também, descobrir o que aconteceu ao outro agente enviado anteriormente para resgatá-la. Chegando ao vilarejo rural chamado Pueblo, ele encontra moradores hostis e fervorosamente religiosos, que são capazes de dar suas vidas pelos Los Iluminados. Durante a busca, Leon descobre que os moradores são responsáveis pela morte do agente desaparecido. Leon encontra Ashley e, em seguida, Luís Sera, contratado para investigar o parasita encontrado nas minas de escavação. No decorrer do jogo, diversas anotações de Luís são encontradas, revelando como os parasitas agem e como é possível eliminá-los. Foram feitas escavações em minas e, em uma delas, havia uma substância gasosa que, inevitavelmente, os mineradores inalaram. Pesquisas sobre a substância revelaram que o local onde ela mais se concentrava era sobre ovos petrificados, isso aparentemente. Os animais resultantes destes ovos foram nomeados de La Plaga (A Praga).