Assassin's Creed II começa em 1476 e termina em 1499 com o protagonista Ezio evoluindo através da história para se tornar um assassino melhor. Assassin's Creed II passa-se num mundo aberto com jogabilidade não-linear, permitindo ao jogador vaguear livremente pela cidade e comprar armas aos vendedores. Também está disponível uma tintura colorida para mudar a cor da roupa do personagem. Um artigo publicado na Game Informer revelou que Assassin's Creed II dará ao jogador a habilidade de nadar e usar os canais de Veneza como pontos de esconderijo para atrair os guardas à agua com o intuito de assassinato. Na E3 2009, foi confirmado pelo diretor criativo que Ezio será capaz de dirigir pequenos barcos. Um jovem Leonardo da Vinci está presente no jogo, como auxílio ao jogador em matéria de armas disponíveis. Em um ponto do jogo, o jogador tem acesso a máquina voadora de Da Vinci, que ele construiu.